Construcción de una caja para el cultivo in vitro II

Ahí va otra manera de fabricar una caja para cultivar in vitro:

Material:

• Pinzas
• Bisturí
• Mechero
• Agua destilada
• Lejía
• Botes de cristal o contenedores de polipropileno (PP5)
• pHmetro
• KOH (u otro producto para subir el pH)
• Báscula
• Agar
• Medio de cultivo (MS)
• Reguladores de crecimiento (auxinas y citoquininas)
• Azúcar
• Olla a presión
• Pipeta o jeringa para medir pequeños volúmenes.
• Jarra (para medir volúmenes)

Y lo más importante, una cámara que nos permita trabajar en un ambiente estéril. Hay varias opciones en éste punto:

-Glovebox: Es la opción más barata, por unos 20-40 euros podemos fabricarla, y por un poco más le podemos poner una bombilla UVC para esterilizar superficies

- Flowhood: La construí siguiendo un manual en internet. Sale un poco más cara, ya que cuenta con un filtro HEPA y un extractor adecuado para conseguir un flujo laminar, pero te ofrece una comodidad digna de una cabina de laboratorio.

Tutorial de construcción: http://www.fungifun.org/English/Flowhood#construction

Medio de cultivo

El medio de cultivo utilizado es el Murashige & Skoog, y para el buen desarrollo de los explantos el pH fue corregido a 5,8 con KOH (durante la esterilización desciende unos 0,3 puntos) se le añadieron 15 g/L de dextrosa y 10 g/l de agar. Además, se le añadió la siguiente concentración hormonal:

-Kinetina (2 mg/l) ------- (Citoquinina)
-AIA (0,2 mg/l) ---------- (Auxina)

La concentración hormonal ideal varía mucho entre especies. Para empezar utilicé una regla habitual para el cultivo de yemas que suele ser usar 10 veces más citoquininas que auxinas. Como el material vegetal era relativamente viejo usé una concentración que me pareció bastante alta de citoquininas (2mg/L).

Esta concentración hormonal favorecerá la proliferación celular y el consiguiente crecimiento de los tejidos. Cuando las yemas hayan crecido lo suficiente, las cambiaré a otro medio con diferente concentración para que enraicen.

Si quisieramos establecer un protocolo para optimizar la micropropagación, habría que probar distintos genotipos y distintas concentraciones hormonales para el mismo medio, y después quedarnos con la mejor.

Material vegetal

- Ramas de potos (Epipremnum aureum)
- Ramas de cáñamo (Cannabis sativa)

Esterilización del medio

El medio de cultivo fue esterilizado en la olla a presión durante 40 minutos desde que se alcanza la máxima presión.

Esterilización del material vegetal

Para esterilizar el material vegetal, seguí las siguientes indicaciones:

-1 minuto sumergidas en alcohol 70%
-10 minutos sumergidas en agua destilada + lejía al 15%
-3 lavados consecutivos de 5 minutos en agua destilada estéril.

Éste es el apartado más delicado, ya que si te pasas con la lejía o el tiempo, los explantos se mueren, y si no llegas no acabas con todos los hongos/bacterias y tus cultivos se contaminan.

Siembra

La siembra de los explantos se realizó en condiciones de esterilidad gracias a al flujo laminar. Sembré explantos con y sin meristemos para observar las distintas respuestas.

Mantenimiento

Fotoperíodo 16/8 con un fluorescente de bajo consumo de 20W.