Tutorial cultivo in vitro II

Este post lo encontré en el foro de infojardín y me pareció interesante colgarlo...


Bueno, el cultivo in vitro de plantas es el cultivo en un ambiente confinado(por lo general en frascos, aunque no necesariamente) el cual contiene un medio de cultivo libre de bacterias y hongos. Es, como pueden ver, un tema eminentemente práctico y la experimentación es una de las herramientas necesarias en este campo.

Es un tema cuyas aplicaciones son: La germinación de semillas, de cualquier tipo, el crecimiento de las plantas, su multiplicación, la obtención de plantas transgénicas, semillas mejoradas, obtención de metabolitos de interes en cosmeticos, alimentos, en la industria farmaceutica etc, es como pueden ver un tema de gran importancia en la actualidad y de gran relevancia para México, uno de los cinco paices más megadiversos del planeta.

Para el cultivo in vitro se requiere del siguiente material:

a) Un equipo para trabajar en condiciones de esterilidad, ya sea una campana de flujo laminar o una caja de plástico o acrílico. Este equipo es crucial, sin el sería muy difícil conseguir resultados satisfactorios. Para su construcción revisar en la siguiente dirección. Cuando la construyas, sella bien todos los resquicios por donde pueda entrar aire, de ello depende el exito en el cultivo, Si hay entrada de aire a tú caja seguro tus cultivos se contaminarán.

b) Una olla de presión o express, seguramente en casa tienes una. La olla sirve para esterilizar todo el material utilizado en el cultivo in vitro: Frascos, medio de cultivo, pinzas de disección, etc. La esterilización se basa en alcanzar 121 ºC por 15 minutos, a está temperatura toda forma de vida, incluidas las más resistentes(esporas de hongos y bacterias) se destruyen.

c) Medio de cultivo, este deberá estar formulado para proporcionar todo lo necesario, para el buen desarrollo de las plantas que vamos a cultivar. El medio más utilizado en todo el mundo es el Murashige- Skoog(MS), aunque podrás utilizar algunos medios caseros. El la dirección anterior vienen varias formas de medios de cultivo, yo siempre uso el MS.

d) Papel indicador de pH, indispensable para ajustar el pH del medio, el cual y por lo gneral es de 5,5 a 5,8. Se ajusta con ácido o con álcali. Estos valores de pH permiten la disponibilidad de los nutrientes contenidos en el medio.lo consigues en tiendas donde vendan artículos para médicos o de laboratorio

e) Pinzas de disección y bisturi son necesarias para manipular las semillas o plantas, el tamaño dependerá del tamaño de los frascos que vayas a utilzar. Los consigues en tiendas donde vendan artículos para médicos. 

f) Caja de petri, es necesaria para colocar las semillas desinfectadas o las plantas y con ello facilitar su manipulación, sin que se contaminen.

g) Un tubo de ensaye, el tamaño deberá ser de unos 2 cm menor que el tamaño de tus pinzas de disección. En el se coloca alcohol y ahi se guardan las pinzas, para mantenerlas estériles.

h) Una probeta de 100 mL, para preparar la solución desinfectante.

i) El resto del material incluye frascos de vidrio con tapa resistente a 121ºC, cloro comercial, agua de garrafón, si tienes destilada está bien, pistola para aspersión, en donde se coloca la solución desinfectante y con ella se rocía el área(caja de plástico o acrílico) de trabajo.

Recuerda, el exito del cultivo in vitro está en la práctica, varios de los intentos que hagas no resultarán y debes armarte de paciencia.

La primera práctica que les presento es la desinfección de semillas(De cualquier tipo, esta tecnica la he empleado para semillas de cactus, carnívoras, de orquideas (con ciertas modificaciones), de alfalfa, de arboles, de Astragalus etc).
1. Para semillas de unos 2mm o menos, se requiere de un trozo de papel filtro, puede ser el empleado para cafeteras, en el se colocan las semillas. Si las semillas son más grandes no necesitas el papel filtro.

2. Dobla los extremos laterales para evitar la salida de las semillas y ahora dobla la parte suerior y engrapa.

3. Prepara la solución desinfectante con 20 mL de clorox más 80 mL de agua común y dos gotas de un detergente líquido. Mide los volúmenes con ayuda de la probeta graduada. Con la solución desinfectante se llena un frasco pequeño, con está solución se llena también la pistola de aspersión

4. El sobre con las semillas se introduce en el frasco, que contiene la solución desinfectante y se deja actuar de 10 a 15 minutos. El cloro liberado por la solucón mata bacterias y hongos adheridos a la cubierta de la semilla, sin matar al embrión que contienen.


LOS SIGUIENTES PASOS DEBES REALIZARLOS EN LA CAJA DE PLÁSTICO

5. La caja deberá contener todo lo que vas a utilizar, frascos con medio de cultivo estéril, pinzas de disección y bisturí estériles, caja de petri estéril, tubo con alcohol, frascos con agua estéril y pistola de aspersión con la solución desinfectante. Todo debe estar escrupulosamente limpio.

Una vez con todo lo necesario en la caja, coloca su tapa y con la pistola rocia todo el interior, paredes, frascos, etc., espera 15 a 20 minutos.
6. Destapa el frasco que contiene el sobre con las semillas y con las pinzas(no deberás tocar las puntas de las pinzas, con nada que no esté estéril) transfiere el sobre a un frasco con agua esteríl. El agua es para lavar las semillas y retirar el exceso de cloro, agita el frasco frecuentemente y deja actuar por 10 minutos.

7. Con las pinzas saca el sobre del frasco y colocalo en la caja petri estéril (en la fotografía coloque el sobre encima de la tapa del frasco que contenía el agua estéril) y con ayuda del bisturí y pinzas retira la grapa con mucho cuidado.

8. Transfiere las semillas una a una, o varias a la ves, al frasco con el medio de cultivo, coloca la tapa del frasco y finalmente sella con una pelicula plástica (se utiliza para cubrir alimentos y la consigues en las tiendas o en el super). Si ya no tienes nada por sembrar, puedes abrir la caja. El frasco de la foto contiene semillas de Hippeastrum

9. El frasco puedes colocarlo en un sitio que reciba luz filtrada, no directa o bien a unos 15 cm de un foco normal.